IF488-ファロイジン染色

 

製品名	猫。いいえ	仕様
IF488-ファロイジン染色	G1248-100T	100 T

 

 

ファロイジンは、元々は毒キノコのテングタケから二環式ペプチドとして単離され、非常に高い親和性と特異性でアクチンフィラメントの F-アクチンに結合しますが、単量体アクチン (G-アクチン) には結合しません。ファロイジンは、小さな線維と大きな線維に対して同様の親和性を持ち、基本的に、多くの異なる動植物種の筋肉細胞および非筋肉細胞において、1 つのアクチンサブユニットと 1 つのファロイジン分子の化学量論比に従って結合します。アクチン抗体とは異なり、モーター駆動タンパク質に対する親和性は、種または供給源によって著しく変化します。ファロイジンの非特異的結合はほとんど無視でき、染色領域と非染色領域の違いは非常に顕著です。ファロイジンとその誘導体はナノモル濃度で F-アクチンを染色できるため、F-アクチン分布の標識、同定、定量的研究が非常に容易になります。

この製品は蛍光色素 IF{0}} で標識されたファロイジンです。細胞染色 1 ウェルあたり 100 μL の作業溶液を使用すると、100 個の細胞染色に使用できます。

 

 

濡れた氷を使って輸送します。光から離れた -20 度で保管し、有効期限は 12 か月間です。

 

 

成分	G1248-100T
IF488-ファロイジン染色	100 T
取扱説明書	1個

 

 

1. 自分で用意する1×PBSバッファー(pH 7.2-7.4、推奨G4202), BSAの（推奨GC305010), 固定剤(パラホルムアルデヒド4%含有、推奨G1101), フィルム破壊溶液(0.1%-0.5% Triton X-100 を PBS に溶解、推奨G1204), 蛍光消光シーラー（推奨G1401), すぐに使える DAPI 染色溶液（推奨G1012）など。

2. 本製品を初めて使用する場合は、液管壁の損失を防ぐため、完全に溶解し、低速で 1 分間遠心分離してください。溶媒の揮発による損失を防ぐため、1 回の実験で使用する量に応じて製品を分注することをお勧めします。光から-20度離れた場所に保管してください。

3. 正式な実験の前に、1% BSAを含むPBSを調製しました。つまり、100 mLのPBSあたり1.0 gのBSAを溶解しました。次に、1μLのIF488-ファロイジン染色を吸引し、1％BSAを含む200μL-500μLのPBSと混合して、1×のファロイジン染色作業溶液を得た。染色効果は細胞の種類によって異なる場合があります。最適な染色作業濃度については文献を参照するか、事前テストを実行して調べてください。ファロイジン染色液は調製後、遮光して室温で保管したので、その日に使用してください。

 

 

１．培養細胞を（少なくとも半分のコンフルエントの密度で）這わせ、培地を除去し、３７度に予め温めた１×ＰＢＳ緩衝液で細胞を２回洗浄した。

2. 3.0-4.0% ホルムアルデヒドを含む固定液を加えて細胞を覆い、室温で 15-30 分間固定しました。

注: メタノールはアクチンを破壊するため、固定液にはメタノールを含めてはならず、メタノールを含むホルムアルデヒド溶液の使用は避けてください。

3. 細胞を室温で1×PBS緩衝液で2-3回、各10分間洗浄しました。

4. 細胞を室温で 0.1% Triton X-100 を含む PBS で覆い、室温で 5 分間透過処理しました。

5. 細胞を室温で1×PBS緩衝液で2-3回、各10分間洗浄しました。

6. 細胞クロールを軽く振って乾燥させた後、細胞が円の中心に位置するようにパパペンで円を描きます。既製の IF488- ファロイジン染色液 100 μL を取り、細胞を完全に覆い、光を避けて室温で 30-120 分間インキュベートします。通常、染色には 4-37 度が適していることに注意してください。乾燥スライスにつながる染色作業溶液の蒸発を避けるために、インキュベーションプロセスでは細胞クロールを遮光性のウェットボックスなどの密閉容器に入れる必要があります。さらに、ファロイジン染色液に 1% BSA を添加すると、バックグラウンドを効果的に低減できます。

7. 細胞を1×PBS緩衝液で2-3回、各回5分間洗浄した。

8. (オプション)すぐに使用できる DAPI 染色溶液をクローラー スライドに滴下して細胞を覆い、核染色を 3-5 分間実行します。細胞を1×PBSバッファーで2-3回、それぞれ30-60秒間洗浄します。

9. 細胞クロールを軽く振って乾燥させ、抗蛍光消光シーラーを滴下したスライド上で反転させ、シーラーをペーパータオルで拭き取りました。

[オプションのステップ]:ステップ 7 の完了後、DAPI を含む抗蛍光消光シーラーで滴定したスライド上にカバースリップを直接裏返して置くこともできます (G1407推奨)、余分なシーラーを吸引して除去します。蛍光顕微鏡またはレーザー共焦点顕微鏡で結果を観察してください。

10. 結果は、IF488 (Ex/Em=493/517 nm) および DAPI (Ex/Em=364/454 nm) チャネルを選択した蛍光顕微鏡またはレーザー共焦点顕微鏡によって観察されました。

 

 

1. 蛍光標識ファロイジンの 1 単位 (T) は、ロードされた細胞のスライドを染色するために使用される色素の量として定義されます。

2. メタノールはアクチンタンパク質を破壊する可能性があるため、サンプルの初期固定にはメタノールを含む固定溶液を使用しないでください。固定時間は最適に 15-30 分の間で制御することをお勧めします。

3. ファロイジンは通常透過性がないため、生細胞の染色にはほとんど使用されません。

4. 蛍光色素はすべて消光するため、染色後できるだけ当日に検出を完了することをお勧めします。

5. ファロイジンは有毒であるため、慎重に取り扱う必要があります。手術中は白衣と使い捨て手袋を着用してください。

 

研究用途のみ!
Ver.いいえ。： V1.0-202308

 

 

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