製品紹介
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製品名 |
猫。いいえ。 |
仕様 |
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2×SYBR グリーン qPCR マスター ミックス (低 ROX) |
G3321-01 |
1mL |
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G3321-05 |
5×1mL |
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G3321-15 |
15×1mL |
製品説明/紹介
本製品は、SYBR Green Iキメラ蛍光法を用いたqPCR反応に特化した2×プレミックス溶液です。プライマーと DNA テンプレートを除くすべての qPCR コンポーネントが含まれているため、操作手順が減り、サンプル添加時間が短縮され、汚染の可能性が減少します。中心となるコンポーネントは、遺伝子操作された熱活性化 Taq DNA ポリメラーゼであり、モノクローナル抗体を効率的に Taq DNA ポリメラーゼに結合させることで、DNA ポリメラーゼ活性を効果的にブロックし、低温での非特異的増幅を防ぎます。熱活性化 Taq DNA ポリメラーゼには、高い特異性や検出感度などの多くの利点があります。 qPCR 用に最適化された反応バッファーにより、高特異性および高感度の qPCR 反応に非常に適しています。本製品は、qPCR反応に最適な濃度のSYBR Green Iを含む2×プレミックス試薬であり、広い定量領域で良好な検量線が得られます。標的遺伝子の定量化は正確で再現性があり、信頼性が高くなります。
保管および取り扱い条件
濡れた氷を使って輸送します。光のない状態で -20 度で保管し、12 か月間有効です。凍結/解凍のサイクルは避けてください。解凍後は4℃、遮光下で1ヶ月程度は安定に保存可能です。
成分
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成分 |
G3320-01 |
G3320-05 |
G3320-15 |
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2×SYBR グリーン qPCR マスター ミックス (低 ROX) |
1mL |
5×1mL |
15×1mL |
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マニュアル |
1部 |
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アッセイプロトコル/手順
実験前の準備
1. リアルタイム PCR 増幅装置;
2. 実験用の特別な反応管または反応プレート。
PCRプライマー（参照プライマー設計原理）； ３．
4. マイクロピペットとピペットヘッド (オートクレーブ滅菌)。
手順
1. qPCR 反応システムを推奨します。
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成分 |
20μLのrxn |
50μLのrxn |
最終濃度 |
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2×SYBR グリーン qPCR マスター ミックス (低 ROX) |
10 μL |
25 μL |
1× |
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フォワードプライマー (10 μM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
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リバースプライマー (10 μM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
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テンプレート |
変数 |
変数 |
必要に応じて |
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ヌクレアーゼフリーの水 |
20μLに加える |
50μLに加える |
ａ．通常、最終濃度 {{0}}.2 μM で良好な増幅効果が得られます。反応性能が悪い場合は、プライマー濃度を 0.2-1.0 μM の範囲で調整できます。
b.鋳型添加量は鋳型溶液中の標的遺伝子のコピー数によって異なりますので、適切な鋳型添加量は勾配希釈により検討します。 20 μL 反応系における最適な鋳型 DNA 添加量は 100 ng 未満でした。 RT-PCR反応のcDNA（RT反応液）を鋳型とする場合、添加量はPCR反応液全量の10％を超えないように注意してください。
2. PCR 反応手順 (機器に応じて調整可能):
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A. 2 段階の方法 * |
B. 3 段階の方法 * |
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ステージ |
ステップ |
サイクル |
温度 |
時間 |
ステージ |
ステップ |
サイクル |
温度 |
時間 |
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ステージ1 |
前退化 |
1 |
95度 |
30秒 |
ステージ1 |
前退化 |
1 |
95度 |
30秒 |
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ステージ2 |
変性 |
40 |
95度 |
15秒 |
ステージ2 |
変性 |
40 |
95度 |
15秒 |
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アニーリング・エクステンション |
60度 |
30秒 |
アニーリング |
55-65度 |
10秒 |
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拡大 |
72度 |
30秒 |
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ステージ3 |
融解曲線 |
1 |
機器のデフォルト設定 |
ステージ3 |
融解曲線 |
1 |
機器のデフォルト設定 |
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*: 増幅特異性を改善する必要がある場合は、2 段階の手順またはアニーリング温度を使用できます。増幅効率を向上させるために、3 段階の手順または延長時間を使用できます。
a: 蛍光シグナル収集については、装置の取扱説明書に従って実験手順を設定してください。
注記
1. 使用前に上下逆にして軽く混ぜます。泡が立たないように、回したり振ったりしないでください。使用前に試薬をよく混合してください。
2. 反応溶液を調製する際、試薬は氷上に置いてください。
3. 本製品には蛍光色素SYBR Greenが含まれておりますので、PCR反応液を調製する際は強い光を避けてください。
4. サンプル間のコンタミネーションを避けるため、反応液の調製および包装には新しいディスポーザブルヘッドを使用してください。
5. マスターミックスは繰り返しの凍結融解を避け、解凍後は1ヶ月以内にご使用ください。
互換性
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PCR装置のブランド |
G3320 (ロックスなし) |
G3321 (ROXが低い) |
G3322 (高ROX) |
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ABI サーモ寿命 |
PikoRealTM サイクラー |
7500/7500 高速、 ViiA 7™ QuantStudio™ シリーズ |
5700/7000/7300/7700/7900/ 7900HT/7900 HT Fast、StepOne™、StepOne Plus™ |
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ストラタジーン |
Mx3000P®/3005P™/4000™ |
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バイオラッド |
全シリーズ |
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エッペンドルフ |
Realplex 2s、Mastercycler®ep realplex |
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Ⅲウミナ |
エコQPCR |
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セファイド |
スマートサイクラー® |
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キアゲン・コーベット |
Rotor-Gene®シリーズ |
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ロッシュ |
ライトサイクラー™シリーズ |
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たから |
サーマルサイクラーダイスシリーズ |
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アナリティキセナ |
qTOWERシリーズ |
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qタワー |
ラインジーンシリーズ |
プライマー設計の原則
1. 増幅産物の長さは 80-300 bp の間であることが推奨されます。
2. プライマーの長さ: 18-25 bp;
3. プライマー中の塩基 G+C の含有量は 40%-60% の間にある必要があります。
4. フォワードプライマーとリバースプライマー間の Tm 値の差は 2 度未満であり、58-62 度の間の Tm 値が最も優れています。
塩基分布のランダム性、６．
6. プライマーには自己相補的な配列が含まれない方が良いです。含まれていないと二次ヘアピン構造を形成します。
7. 2 つのプライマー間に相補的または相同な塩基が 4 つ以下であるべきです。そうでない場合、プライマーダイマー、特に 3' 末端での相補的なオーバーラップが形成されます。
8. プライマーの 3' 末端塩基は G または C であることが示唆されています。
9. NCBI の比較結果では、他の非特異的な製品は見つかりませんでした。
トラブルシューティング
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問題の説明 |
考えられる理由 |
ソリューション |
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反応終了時に増幅曲線が現れないか、CT 値の出現が遅すぎた |
テンプレート濃度が低すぎる |
実験を繰り返してテンプレートの希釈倍数を減らし、サンプル濃度が不明な場合は最高濃度から開始します。 |
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テンプレートの劣化 |
テンプレートを再度作成し、実験を繰り返しました |
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システム内に PCR 阻害剤が存在する |
一般的には、鋳型を搬入し、鋳型の希釈倍率を上げたり、純度の高い鋳型を再調製して繰り返すことが行われます。 |
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プライマーが劣化する可能性がある |
長期間使用されていないプライマーは、分解の可能性を排除するために、まず PAGE 電気泳動によって完全性をテストする必要があります。 |
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増幅効率が低い |
プライマー濃度を上げるか、3 段階の増幅手順を試すか、プライマーを再設計してください。 |
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増幅産物が長すぎます |
増幅産物の長さは 80-300 bp の範囲で制御されました |
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ブランクコントロールは信号を表示します |
反応系汚染 |
まず、ブランクコントロール水を交換する必要があります。それでも同じ状況が発生する場合は、プライマー、アスピレーター、PCR チューブを交換するか、新しいマスター ミックスを開始する必要があります。反応系はエアロゾル汚染を低減するためスーパークリーンテーブル内に準備されています |
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プライマーダイマーなどの非特異的な増幅が現れる |
一般に、35 サイクル後にブランク コントロールに増幅産物が現れるのは正常であり、これを融解曲線で分析する必要があります。 プライマーの再設計、プライマー濃度の調整、または PCR 反応手順の最適化 |
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融解曲線には複数のピークがある |
プライマーの設計が悪い |
新しいプライマーは、プライマー設計原則に従って再設計されました。 |
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プライマー濃度が高すぎる |
プライマー濃度を適切に下げる |
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cDNAテンプレートにゲノム汚染があります |
抽出された RNA 溶液は、dsDNase などの DNA 酵素を使用して消化され、ゲノム汚染が除去されたり、トランスイントロン プライマーが設計されます。 |
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実験の再現性が低い |
サンプル追加の誤差が大きい |
高品質の吸引ヘッドを備えた正確なピペットの使用。 高希釈テンプレート。大容量テンプレートを追加してサンプリングエラーを低減します。 qPCRの反応量を拡大しました |
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テンプレート濃度が低すぎる |
実験を繰り返してテンプレートの希釈時間を短縮します。 |
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qPCR 機器のさまざまな場所での温度偏差 |
qPCR 装置を定期的に校正する |
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増幅曲線が滑らかではない |
蛍光シグナルが弱すぎます。システム補正後に生成されます。 |
マスターミックスで事前に混合された染料が劣化していないことを確認してください。 蛍光シグナルを交換してより優れた qPCR 消耗品を収集 |
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増幅曲線が途切れたりずれたりする |
テンプレート濃度が高く、ベースラインエンドポイント値が CT 値よりも高かった |
ベースラインエンドポイント (Ct 値 -3) が減少し、データが再分析されました |
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個々のウェルの増幅曲線が突然急激に低下する |
反応管内に気泡が入っている |
MIX が完全に溶けていることを確認し、均一に渦を巻いたり振動させたりしないでください。 サンプル添加後、軽弾性遠心分離により気泡を取り除きます。 気泡を除去するために、前変性時間を 10 分間に延長しました。 |
研究用途のみ!
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