製品紹介

製品名	猫。いいえ。	仕様
His-Tag タンパク質精製用 SweMagrose IDA-Co 磁気アガロースビーズ	ゴ3655-1ML	1mL
His-Tag タンパク質精製用 SweMagrose IDA-Co 磁気アガロースビーズ	ゴ3655-5ML	5mL

製品説明/紹介

この製品は、IDA およびキレート化ニッケルイオンによって修飾されたアガロース磁気ビーズから調製されます。遠心濾過を行わずに、生体サンプル中のヒスチジンタグ付きタンパク質を効率的かつ迅速に精製できます。操作が簡単で、細菌、酵母、細胞の上清や細胞内に発現した可溶型ヒスチジンタグタンパク質の精製に適しています。また、タンパク質のスクリーニングおよび分離のために、ハイスループットのタンパク質精製装置と組み合わせることができます。

Co2+ は 4 つのリガンドと非特異的吸着が少なく、Ni2+ は 6 つのリガンドと強力なタンパク質結合能力を持っています。より多くの標的タンパク質については、他の SweMagrose IDA-Ni 磁気アガロースビーズを選択できます。 -タグタンパク質精製 (G3654)。

保管および配送条件

濡れた氷を入れて発送します。 4℃で保存、12ヶ月有効。

製品のコンポーネント

コンポーネント番号	成分	ゴ3655-1ML	ゴ3655-5ML
G3655	His-Tag タンパク質精製用 SweMagrose IDA-Co 磁気アガロースビーズ	1mL	5mL
マニュアル		1個

アッセイプロトコル/手順

1. 各種試薬の構成は以下のように参照できます。試薬の状況に応じて磁気ビーズや緩衝液の配合量を適切に選択できます。

成分	音量
10×PBS(200mM リン酸ナトリウム、pH7.4)	50mL
10x イミダゾール緩衝液(200 mM リン酸ナトリウム、5 M イミダゾール、pH 7.4)	50mL
コバルト除去剤(10 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、100 mM EDTA、pH7.4)	10mL
アルカリ洗浄液(0.5M NaOH、2M NaCl)	10mL
href="javascript:;"硫酸コバルト(100 mM CoSO4)	15mL
保存液（20％エタノール）	50mL

2. バッファ構成

金属イオンキレートビーズと標的タンパク質の結合性能は標的タンパク質の精製効率に直接影響し、またさまざまなバッファーも標的タンパク質の回収率と純度にある程度影響します。したがって、大規模なタンパク質精製の前に、ユーザーは独自の実験を設計して、結合バッファー、洗浄バッファー、溶出バッファーなど、ターゲットタンパク質に適したバッファーをスクリーニングする必要があります。以下に提供するバッファーシステムは、ほとんどのヒスチジンタグタンパク質の精製に適しています。ユーザーの参考用:

結合緩衝液: 20 mM リン酸ナトリウム、500 mM NaCl、5~50 mM イミダゾール、pH 7.4

洗浄緩衝液: 20 mM リン酸ナトリウム、500 mM NaCl、50~100 mM イミダゾール、pH 7.4

溶出バッファー: 20 mM リン酸ナトリウム、500 mM NaCl、500 mM イミダゾール、pH 7.4

3. サンプル処理

a) 大腸菌、酵母およびその他の細胞内発現タンパク質: 細胞 1 グラムあたり 5 ～ 10 mL の結合バッファーを加え、プロテアーゼ阻害剤 (例: 最終濃度 1 mM の PMSF) を加え、細胞を再懸濁し、超音波で溶解します。氷浴中の細胞、すなわち粗タンパク質サンプル。サンプルの粘性が高すぎる場合は、必要に応じて適切な量のヌクレアーゼを粗サンプルに添加し、氷上に 30 分間置いて核酸を分解します。あるいは、必要に応じてタンパク質サンプルの遠心分離を実行することもできます。

b) 細胞外発現タンパク質: 細胞外発現上清を等量の結合緩衝液で希釈して粗タンパク質サンプルを得ました。

c) 動物細胞の細胞内発現タンパク質: 動物細胞を適量採取し、適量の PBS (ご用意) で 1 回洗浄し、上清を捨て、1% (v/v) Triton X を含む適量の結合バッファーで再懸濁します。 -100 または 1% (v/v) NP-40 にプロテアーゼ阻害剤 (例: 最終濃度 1 mM の PMSF) を加え、氷上に 1 分間置きます。 10 分、これは粗タンパク質サンプルです。

4. 標的タンパク質の磁気ビーズへの結合:

a) 湿重量 2 g の微生物を 10 mL の結合緩衝液で懸濁し、断片化および溶解後、前処理した磁性ビーズの入った遠沈管に目的の粗タンパク質のサンプルを加え、遠沈管に置きます。ボルテックスミキサーに入れて 15 秒間振とうします。次に、目的の粗タンパク質サンプルを、前処理された磁気ビーズが入った遠心分離管に加えます。

b) 遠心管をロータリーミキサー上に室温で 20-30 分間置きます（必要に応じて、標的タンパク質の分解を防ぐために、2-8 度の低温で 1 時間回転および混合できます）。

c) 分離のために遠心分離管を磁気分離器上に置き、その後の試験のために上清を新しい遠心分離管に移し、その後の洗浄ステップのために磁気分離器から遠心分離管を取り外します。

5. 磁気ビーズの洗浄:

a) 磁気ビーズの入った遠心管に 10 mL の洗浄バッファーを加え、チューブを数回静かに回転させてビーズを再懸濁し、磁気的に分離し、洗浄溶液をサンプリング用の新しい遠心管に移します。この手順を 1 回繰り返します。

b) 磁気ビーズの入った遠心管に 10 mL の洗浄バッファーを加えてビーズを再懸濁し、ビーズ懸濁液を新しい遠心管に移します (元の遠心管の壁に非特異的に吸着されたタンパク質による標的タンパク質の汚染を避けるため) )、磁気的に分離し、上清をピペットで洗浄バッファーコレクションチューブに移します。

6. 標的タンパク質の溶出

a) 必要に応じて溶出量を変更することで、目的タンパク質の濃度を調整できます。 2-10 mL の溶出バッファーを加え、チューブを数回静かに回転させてビーズを懸濁させ、磁気的にビーズを分離し、溶出液を新しい遠心分離チューブに収集します。これが精製された標的タンパク質サンプルです。

a) 必要に応じて、上記の手順を 1 回繰り返してサンプルを新しい遠心管に収集し、目的のタンパク質が完全に溶出されているかどうかをテストします。

b) SDS-PAGE またはウェスタンブロッティングにより標的タンパク質を検出します。タンパク質濃度を測定する必要がある場合は、溶出バッファーを使用して濃度をゼロにするか、透析または限外濾過を使用してイミダゾールを除去してから濃度を測定します。

7. 磁性ビーズの後処理

a) 磁性ビーズの入った遠沈管に溶出バッファー 5 mL を加え、遠心管を数回上下させてビーズを懸濁し、磁気的に分離して上清を除去します。

b) 上記の手順を 2 回繰り返します。

c) 磁性ビーズの入った遠心管に 5 mL の ddH O を加え、遠心管を数回上下させてビーズを懸濁し、磁気的に分離して上清を除去します。

d) 上記の手順を 2 回繰り返します。

e) 磁気ビーズに保存液を加えて全量 5 mL とし、2-30 度で保存します（長期保存の場合は、2-8 度で保存します）。同じタンパク質の次の精製。

8. 磁気ビーズの再生

磁気ビーズを 3 回以上連続して使用すると、目的タンパク質への結合力が著しく低下する場合がありますので、磁気ビーズの再生処理を行うことをお勧めします。磁気ビーズの再生操作を詳しく説明するために、5 mL の 10% (v/v) 磁気ビーズ懸濁液を例に挙げます。

a) 磁気ビーズ懸濁液を磁気的に分離し、上清を除去し、磁気分離器から遠心分離管を取り外し、5 mL の ddH2O を遠心分離管に加え、遠心分離管を数回上下させて磁気ビーズを再懸濁します。、磁気分離し、上澄みを除去します。

b) 5 mL のコバルト除去剤を加え、遠心管を数回上下させて磁気ビーズを再懸濁し、室温で 5 分間回転および混合し、磁気的に分離し、上清を除去します。この手順を 1 回繰り返します。

c) 磁性ビーズの入った遠心管に ddH2O 5 mL を加え、遠心管を数回上下させてビーズを懸濁し、磁力で分離して上清を除去します。

d) アルカリ処理 (オプションのステップ): 5 mL のアルカリ洗浄バッファーを加え、遠心分離管を数回上下させてビーズを再懸濁し、室温で 5 分間回転および混合し、磁気的に分離し、上清を除去します。 5 mL の ddH2O を加え、遠心管を数回上下させてビーズを再懸濁し、磁気分離して上清を除去します。洗浄溶液が中性になるまで、ddH2O 洗浄ステップを 3-5 回繰り返します。

e) 塩化ニッケル 5 mL を加え、遠心管を数回上下させてビーズを再懸濁し、室温で 20 分間回転および混合し、磁気分離して上清を除去します。

f) 5 mL の ddH2O を加え、遠心分離管を数回上下させてビーズを再懸濁し、磁気的に分離して上清を除去します。この手順を 4 回繰り返します。

g) 磁気ビーズに保存液を加えて全量 5 mL とし、2-30 度で保存します（長期保存の場合は、2-8 度で保存します）。